生物芯片類檢測試劑注冊技術審查指導原則（食藥監辦械函[2013]3號）

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生物芯片類檢測試劑注冊技術審查指導原則
（食藥監辦械函[2013]3號）

一、前言

本指導原則主要針對生物芯片類檢測試劑的主要原材料、生產工藝及反應體系、產品質量控制等環節提出指導性技術要求。

本指導原則系對生物芯片類檢測試劑的一般要求，申請人應依據產品特性確定其中的具體內容是否適用，若不適用，需詳細闡述其理由及相應的科學依據。

本指導原則是對申請人和審查人員的指導性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規強制執行，如果有能夠滿足相關法規要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應在遵循相關法規的前提下使用本指導原則。

本指導原則是在現行法規和標準體系以及當前認知水平下制訂的，隨著法規和標準的不斷完善、科學技術的不斷發展，其相關內容也將進行適時的調整。

二、適用范圍

根據芯片制作的主要原料和方法，生物芯片可分為核酸芯片、蛋白芯片、細胞芯片、組織芯片等。本指導原則是針對核酸和蛋白為檢測靶分子生物芯片的注冊技術審查指導原則，其他類型靶分子檢測的芯片診斷試劑可參考本指導原則。

三、基本要求

（一）基本原則

1.試劑研制、生產用各種原料、輔料等應制定相應的質量標準，并符合有關法規的要求。

2.試劑生產企業應具備相應的專業技術人員、儀器設備以及適宜的生產環境，獲得《醫療器械生產許可證》;同時，應按照《體外診斷試劑生產實施細則（試行）》的要求建立相應的質量管理體系，形成文件和記錄，加以實施并保持有效運行;還應通過《體外診斷試劑生產企業質量管理體系考核評定標準（試行）》的考核。

3.生物芯片類試劑在研制時，應當按照科學、規范的原則組織研發，各反應條件的選擇和確定應符合基本的科學原理。

4.試劑研制、生產過程中所用的物料及工藝，應充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。

5.生產和質量控制的總體目標：保證試劑使用安全、質量穩定、工藝可控、檢測有效。

（二）原材料質量控制

1.核酸檢測芯片

核酸芯片檢測時，從生物樣本中提取的核酸可用熒光標記、金標記和酶標記;檢測方法包括光譜學方法和化學顯色。下面為熒光標記芯片技術指導原則，采用金標記和酶聯顯色等的生物芯片診斷試劑可參照核酸芯片和蛋白芯片相關部分。

（1）主要生物原料

核酸檢測芯片的主要生物原料包括模板DNA、dNTPs、引物、探針、標記物等。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定，企業應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準;若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，同時，供應商應提供相應的質量保證證明和相應的質檢報告，達到生產規定的質量標準。如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求進行變更申請。

①模板DNA

重組DNA：經測序驗證，關鍵堿基或序列沒有錯誤。1×TE溶解，濃度為100ng/μl以上，-20℃保存。作為陽性參考品時，其稀釋度由企業根據產品標準確定。

②dNTPs（dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP）

HPLC純，PCR級，無DNase、RNase污染，-20℃以下保存。

③引物

生產中的引物原材料為凍干粉，PAGE純或HPLC純。用標準DNA模板擴增，電泳檢測，譜帶單一，大小正確，與對照引物比較，產物量一致。符合視為合格引物，-20℃以下保存。

④探針（用于陣列制備）

重組DNA, 凍干粉（或1×TE溶解液）：至少滿足一個批次的用量，酶切鑒定分析圖譜。

PCR產物，凍干粉（或1×TE溶解液）：至少滿足一個批次的用量，PCR電泳鑒定圖譜。

合成寡核苷酸：PAGE純或HPLC純，至少滿足一個批次的用量，提供該產品的PAGE電泳分析圖譜或HPLC分析圖譜。

探針序列的正確性：應用克隆鑒定的標準DNA雜交鑒定或測序鑒定。

純度和濃度檢測：采用電泳方法，電泳圖譜沒有雜帶，目的條帶的強度與已知濃度的標準DNA條帶進行參比計算其強度。純度較高的DNA，可用紫外分光光度計進行定量。檢驗合格后入庫，避光、-20℃以下保存。

⑤標記物

含有激發光波長和發射光波長介于280~680nm的所有熒光分子，HPLC純。

⑥Taq DNA聚合酶

SDS-PAGE 檢測，純度＞95%，具有DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性;具熱穩定性，94℃保溫1小時后仍保持50%活性。產品-20℃保存。

⑦尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具尿嘧啶糖基化酶活性，無核酸外切酶及核酸內切酶活性。1U UNG 37℃處理3分鐘后，103拷貝以下含U模板被降解后不能產生擴增產物。產品-20℃保存。

⑧逆轉錄（RT）酶

具有逆轉錄活性，無核酸內切酶活性，-20℃保存。

⑨RT-PCR酶

具逆轉錄酶活性和DNA聚合酶活性，無核酸內切酶活性，具熱穩定性，94℃ 1小時后仍保持50%活性。產品-20℃保存。

⑩緩沖液

各類酶制品所需的反應緩沖液由廠家隨酶制品提供，-20℃保存。

（2）主要生物輔料

主要生物輔料包括酶類（蛋白酶、核酸酶等）、核酸提取試劑、魚精DNA、封閉用蛋白、雜交液等，企業應建立相應的質量標準。主要生物輔料若為企業自己生產（配制），其工藝必須相對穩定，并按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準;若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，同時，供應商應提供相應的質量保證證明和相應的質檢報告，達到生產規定的質量標準。

（3）主要化學原輔料

化學原材料的質量標準參照《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》分析純級別進行檢驗。主要的檢測指標包括：溶液外觀、一般鹽類檢測、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更?；瘜W原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質檢報告，其質量標準應達到生產所需的質量標準。

（4）其他物料

①載玻片

外觀：明亮處用肉眼觀察無缺刻，無劃傷等。規格按設計要求。

激光掃描儀掃描（波長為芯片檢測波長）：包被層基本均勻。

②試管、吸頭、試劑瓶等

一次性使用，由生產廠家提供質量保證，達到設計要求。

③其他：

包括試劑瓶標簽、鋁箔袋、襯墊、可密封塑料袋、說明書、干燥劑和包裝外盒等，應參照國家食品藥品監督管理局發布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量標準。

2.蛋白檢測芯片

（1）主要生物原料

與生產的產品質量最密切相關的生物原料包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆杭體、多克隆抗體以及多肽類生物原科。這類原料可用于點膜、標記相關酶、納米金、光學基團及中和反應用抗原或抗體等。使用前應按照工藝要求對這類生物原料進行質量檢驗，以保證其達到規定的質量標準。主要生物原料若為企業自己生產，其工藝必須相對穩定;若購買，其供應商要求相對固定，不能隨意變更供應商，如果主要原料（包括工藝）或其供應商有變更，應依據國家相關法規的要求變更申請。

主要生物原料的常規檢驗項目一般包括：

①外觀

肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒;或者為白色粉末，不含其他顏色雜質;特殊生物原料應具備相應外觀標準。

②純度和分子量

生物原料經SDS-PAGE 電泳后，利用電泳掃描儀進行分析;也可用其他適宜的方法，如高效液相法等進行分析。根據所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進行電泳。一般每個電泳道加樣量為5μg;電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍染色或銀染法染色。染色后的凝膠用電泳掃描儀分析原料的純度和分子量，純度應達到相應的質量標準，分子量大小應在正確的條帶位置。

③蛋白濃度

蛋白濃度可通過Lowry法、280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜方法進行檢測。

④效價

效價的測定一般根據蛋白含量測定結果，通過倍比稀釋法進行。效價應達到規定的要求。

⑤功能性實驗

功能性實驗是指生物原料用于試劑盒實際生產中的情況，一般考查使用該原料的試劑的靈敏度、特異性和穩定性等，并比較其與上批次原料的相關性。

（2）主要生物輔料

生物輔料是指在生產過程中作為蛋白保護劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。這些生物原料的質量標準應符合《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》規定的質量標準要求，并且要適合于企業生產。

建議作以下檢驗：

①牛血清或羊血清

外觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物

無菌試驗：將血清直接37℃放置7天，放在明亮處觀察，不得出現混濁或沉淀。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，標準為不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待測血清1ml，采用飽和硫酸銨法進行沉淀。沉淀溶于0.85%NaCl溶液至1ml，用Lowry法測定蛋白含量不能大于2mg/ml。

②牛血清白蛋白：

外觀：應為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結塊，無肉眼可見的其他雜質顆粒。

溶解性：將牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解時間在18~26℃時應不大于15分鐘。pH值應為6.5~7.1。

總蛋白含量：用雙縮脲法測定，其標準為不小于干重的95%。

總蛋白中的牛血清白蛋白（BSA）含量：采用硝酸纖維素膜電泳法，其標準為不小于總蛋白含量的95%。

BSA的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的BSA含量，其標準為不小于90%。

③酪蛋白：

應符合生產所需的質量標準。

④標記用酶

應在產品的質量標準中明示所使用的標記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應根據不同生產廠家的檢驗方法和質量標準進行檢驗，酶的純度RZ值（OD_403nm/OD_280nm）應大于3.0。

對于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，還應進行功能性實驗，即以其為原料配制一定濃度的稀釋液作為樣品，進行測定，均不得出現非特異性反應。

生物輔料的供應商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應商。

（3）化學原輔料

參照《中國生物制品主要原輔材料質控標準（2000年版）》分析純級別進行檢驗。主要的檢測指標包括：溶液外觀、一般鹽類、溶液pH值、溶解情況、干燥失重、熾灼殘渣等。

主要化學原材料的供應商要求相對固定，不得隨意發生變更?；瘜W原材料在購入時，原材料的生產商必須提供該批次化學原材料的質量保證材料和質檢報告，其質量標準應達到生產所需的質量標準。

（4）其他物料

①基質

以硝酸纖維素膜為例：孔徑符合設計要求（0.45μm、0.22μm等）、均一性（厚度及毛細遷移速度±20%）、尺寸（與標識吻合）

②試劑瓶和干燥劑

由生產廠家提供質量保證，達到規定要求。

③其他：說明書、包裝外盒等

應參照國家食品藥品監督管理局發布的《體外診斷試劑說明書編寫指導原則》和《醫療器械說明書、標簽和包裝標識管理規定》建立相應質量控制標準，如數量、規格等。

（三）試劑盒各組分的生產

生物芯片主要包括DNA芯片、蛋白芯片、組織芯片和細胞芯片等。生物芯片診斷試劑產品基本可分成二個部分，一部分是芯片，另一部分檢測用工作液。如果有配套的檢測儀器，還需對儀器及處理軟件的應用加以說明。

1.芯片的生產

芯片生產的基本過程包括探針的獲取方法，純化，點樣，固定。

（1）探針獲取

不同芯片，主要是探針不同，生物芯片的探針主要包括以下幾類，其他探針可參考制定相應的技術及質量標準。

①DNA探針的獲取

探針的形式包括PCR產物、克隆DNA、人工合成DNA片段等;要求有生產程序和質量指標及檢測方法，要進行純化，有固定的純化程序。

②抗原的生產

抗原獲得方法包括細胞培養、從生物材料中分離提取、基因工程表達以及合成肽等?；蚬こ瘫磉_產物又分為純抗原蛋白、融合蛋白等。

③抗體

抗體分單克隆抗體和多克隆抗體?？贵w制備包括細胞培養，動物腹水，基因工程表達等方式。

④細胞和組織

包括細胞或組織類型，固定方法。組織材料包括固定，包埋，切片等。

（2）陣列的排列設計

陣列的排列可以是依次排列、隨機排列、對角線排列以及其他排列方式，但設計時需考慮重復次數和對照等因素。

（3）點陣的制作

使用儀器的需要確定型號，程序;手工制作的也應有標準操作程序。

（4）固定：包括固定方式，固定條件等。

應對芯片生產的過程進行相應的質量控制，如點樣和固定過程的監控、點樣均一性檢驗等。

2.工作液配制

（1）芯片生產所需試劑，包括細胞培養基，探針制備試劑，陣列制作和固定試劑等。

（2）樣品處理試劑，芯片檢測靶分子分為核酸和蛋白質。檢測核酸的樣品處理試劑包括臨床取樣、DNA提取或RNA提取試劑，逆轉錄試劑，PCR擴增試劑，核酸標記試劑等;檢測蛋白的處理試劑包括取樣試劑，蛋白稀釋液以及特殊試劑等。

（3）反應液：檢測核酸時的反應液包括預雜交液、雜交液、洗脫液等;檢測蛋白時，包括封閉液、抗原/抗體反應液、洗脫液、顯色液、顯色終止液等。

3.數據判讀

（1）判斷標準及依據，包括Cut off值的確定依據。

（2）數據判讀方式：人工還是軟件判讀。

（3）如果是軟件判讀，應提供軟件判斷的科學依據（包括生物學原理、數據獲取原理和判斷實驗是否成立的依據）以及實驗測試的原始報告（或數據），并需要說明：

①軟件的來源：購買或自己編制，是否獲得注冊等。

②軟件的用途：包括對數據的分析、存儲、解讀、含義等。

③軟件的使用：基本的使用程序。

（四）半成品質量控制

1.抽樣

檢驗人員按批號抽取檢驗需要數量的半成品，做好標記，待檢。

2.半成品檢驗

利用上一批檢驗合格的試劑盒的相應組分，對本批生產出的各種試劑盒組分分別進行檢驗，檢驗結果達到產品的質量標準。

半成品檢驗，一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品進行。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

檢測所抽樣的半成品試劑盒的性能，包括陰/陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性等，均應達到相應質量標準的要求。精密性評價應采用比最低檢測限高一個數量級的質控品，重復檢測10次，判定結果一致。對定量檢測試劑，同時應分析其線性相關系數和定量質控品檢測結果的準確性。

企業應該對每一批試劑的半成品進行穩定性測試。穩定性試驗可在特定溫度或特定條件下完成。對蛋白芯片，應完成37℃熱穩定性試驗，試驗結果應符合產品的質量標準。

（五）成品質量控制

產品包裝完成后，質檢人員根據試劑的批號、實際包裝量、抽樣申請單的要求進行抽樣，同時填寫抽樣數量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。抽樣數量應包括檢驗用數量和留樣數量。質檢人員同時應檢查相關原始記錄。

每一批生物芯片類檢測試劑的試生產量應滿足工藝研究、分析性能驗證、穩定性研究、臨床試驗、自測及注冊檢驗等各階段所需樣品量的要求。

1.成品檢驗

一般使用國家標準品（參考品）或經國家標準品（參考品）標化后的企業參考品進行。若某類試劑沒有國家標準品（參考品），則使用企業參考品，企業參考品的制備應有規范的質量控制程序，以保證產品的安全性、有效性及質量可控，其質量應不低于國家食品藥品監督管理局已經批準的同類產品的質量。

2.穩定性試驗

試劑批放行前，應完成穩定性試驗。穩定性試驗可在特定溫度或特定條件下完成。對蛋白芯片，每批試劑批放行前，應完成37℃熱穩定性試驗，達到相應的質量標準。

四、名詞解釋

生物芯片類檢測試劑：本指導原則所定義的生物芯片檢測試劑是指將多個生物探針（包括DNA片段，寡核苷酸、抗原、抗體，組織，細胞等）按預先設計的排列方式固定在特制的基質（包括玻璃片，尼龍膜，硝酸纖維素膜等）上，用特定的方法提取生物靶分子并進行標記，然后與固定在基質上的生物探針特異性的結合，再用相應的檢測設備（如激光掃描儀、CCD檢測儀等）和分析方法（包括軟件）進行檢測、記錄、分析，實現對生物靶分子的定性或定量檢測的試劑。

五、參考文獻

1.《中國生物制品規程》（2000年版），化學工業出版社